Как работает редактирование генов CRISPR-Cas9

Как белок находит одно место во всём геноме?

Одна копия человеческого генома содержит около 3 миллиардов пар оснований. Допустим, нужно изменить один ген. Инструмент должен прочитать ДНК, распознать короткий участок и разрезать именно его, не затрагивая остальные. Прежние инструменты, нуклеазы с цинковыми пальцами и TALENs, требовали нового белка для каждой мишени, а проектировать белки долго и трудно. CRISPR-Cas9 изменил подход: белок остаётся тем же, переписывается только короткая направляющая РНК.

Экспонат показывает систему в молекулярном масштабе. На сцене лежит короткий фрагмент ДНК, к которому подходит Cas9 с направляющей РНК. Можно проследить поиск PAM, спаривание направляющей с 20 основаниями ДНК, разрезание обеих цепей и последующее восстановление разрыва клеткой. Над моделью есть поле для собственной направляющей. Если буквы не совпадают, спаривание прекращается и разреза нет. Числа взяты у Nobel Committee for Chemistry, OpenStax, RCSB Protein Data Bank и US National Human Genome Research Institute. Источники приведены в конце.

ДНК в масштабе модели

ДНК состоит из двух обвивающих друг друга цепей. Каждая представляет собой цепочку сахаров и фосфатов, причём каждый сахар несёт одно из четырёх оснований: A, C, G или T. A одной цепи спаривается с T другой, а C с G, поэтому по одной цепи можно восстановить другую. Здесь A окрашено зелёным, T красным, G жёлтым, C синим. Основание U, заменяющее T в РНК, фиолетовое.

Обычная форма ДНК, B-DNA, имеет определённые размеры. Ширина двойной спирали 2 nm. Соседние пары оснований разделены расстоянием 0,34 nm, а полный виток занимает 3,4 nm, то есть 10 пар оснований. Чёрные отрезки слева показывают ширину 2 nm и виток 3,4 nm. Модель содержит 44 пары оснований, поэтому её длина 44 × 0,34 = 15 nm.

Цепи направлены противоположно. Химики обозначают концы 5′ и 3′, а последовательности записывают от 5′ к 3′. Серая цепь здесь идёт от 5′ к 3′ слева направо, тёмная наоборот. Буквы серой цепи совпадают с направляющей, только вместо U стоит T. Направляющая спаривается с тёмной цепью.

Бактериальная память о вирусах

История CRISPR началась с загадки бактериальных геномов. В 1987 году в ДНК Escherichia coli заметили необычный рисунок: пять копий последовательности из 29 пар оснований, разделённых каждый раз разными участками по 32 пары. Подобные массивы обнаружились у многих бактерий и архей. Их назвали CRISPR, от clustered regularly interspaced short palindromic repeats, то есть сгруппированных коротких палиндромных повторов с регулярными промежутками. Рядом находились гены cas, от CRISPR-associated, кодирующие белки, похожие на ферменты расплетания и разрезания нуклеиновых кислот.

В 2005 году три группы сообщили, что спейсеры между повторами совпадают с ДНК вирусов и плазмид. Бактерии с определённым спейсером редко заражались вирусом с соответствующей последовательностью. В 2007 году опыт со Streptococcus thermophilus прямо показал связь. У переживших вирусную атаку бактерий появились новые спейсеры, скопированные с вируса, и устойчивость к нему. Удаление спейсера убирало устойчивость.

Таким образом, массив CRISPR хранит запись прошлых инфекций. С него синтезируется длинная РНК, разрезаемая на короткие CRISPR РНК, по одной на спейсер. Каждая связывается с белками Cas и ведёт их к ДНК с подходящей последовательностью. В системе Streptococcus для разрезания достаточно одного белка Cas9 вместе со второй малой РНК, tracrRNA, описанной группой Emmanuelle Charpentier в 2011 году.

Cas9 и направляющая РНК

Cas9 из Streptococcus pyogenes представляет собой крупный белок. Цепь в кристаллической структуре 4OO8 в Protein Data Bank содержит 1372 аминокислоты и имеет массу около 159 килодальтон. Структура, определённая в 2014 году с разрешением 2,5 Å, показала две доли. Распознающая доля REC удерживает направляющую РНК и пару РНК-ДНК. Нуклеазная доля содержит два режущих домена, HNH и RuvC, и ближе к дальнему концу домен взаимодействия с PAM.

В модели белок показан четырьмя округлыми объёмами в соответствующих местах. Их форма условна, а прозрачность позволяет видеть РНК и ДНК внутри. Включите «Заглянуть внутрь» на вкладке «Управление», чтобы сделать их ещё прозрачнее.

У бактерий Cas9 несёт две РНК: crRNA со спейсером и удерживающую её tracrRNA. В 2012 году Charpentier, Jennifer Doudna и коллеги соединили их в единую направляющую РНК. Она состоит из двух частей. Первые 20 букв, спейсер, выбирают мишень. Остальная часть складывается в каркас внутри белка, показанный оранжевой трубкой. Изменение этих 20 букв направляет тот же белок в другое место.

Первый шаг: найти PAM

Cas9 не сверяет с направляющей каждый участок ДНК. Сначала он ищет protospacer adjacent motif, или PAM, мотив рядом с протоспейсером. Для Cas9 из S. pyogenes это NGG на серой цепи сразу после мишени: любое основание и затем два G. Два аргинина домена взаимодействия с PAM узнают GG посредством водородных связей. Лишь найдя PAM, белок изгибает соседнюю ДНК и начинает разделять цепи.

PAM объясняет и поведение бактерий. Если спейсер совпадает с вирусной ДНК, он совпадает и со своей копией в массиве CRISPR. Бактерия не разрезает собственный геном, потому что спейсеры массива не соседствуют с PAM, в отличие от соответствующей вирусной последовательности.

Здесь PAM имеет вид TGG. Отключите «PAM (NGG)» на вкладке «Управление», и он станет TGA. Cas9 зависнет над ДНК и уйдёт, не раскрыв её, хотя все 20 оснований направляющей по-прежнему совпадают.

Второй шаг: двадцать букв, начиная с затравки

Рядом с PAM ДНК раскрывается по одной паре оснований, и направляющая РНК спаривается с тёмной цепью. Серая оттесняется в петлю. Структура, где РНК спарена с одной цепью ДНК, а другая вытеснена, называется R-петлёй. Спаривание начинается от PAM. Ближайшие к нему 10 оснований направляющей, затравка, особенно важны. Несоответствие в затравке обычно останавливает распознавание.

Поле над моделью показывает мишень на серой цепи от 5′ к 3′, с PAM в конце. Выделены 10 позиций затравки. Ниже находится направляющая. Можно вводить буквы или использовать четыре кнопки:

• «Совпадение»: спариваются все 20 букв. R-петля доходит до конца, и Cas9 режет ДНК.
• «Ошибка в затравке»: изменена позиция 17. R-петля раскрывает 3 пары оснований и останавливается.
• «Дальняя ошибка»: изменена позиция 3. R-петля раскрывает 17 пар оснований и затем закрывается.
• «Другой ген»: направляющая для иной последовательности. Спаривания нет.

Не спаривающиеся буквы показаны чёрным. Здесь любое несоответствие останавливает спаривание на этой букве, ДНК закрывается, и Cas9 отсоединяется. Настоящий Cas9 менее строг, как объясняется далее.

Третий шаг: два домена, два разреза

Когда направляющая спарилась со всеми 20 основаниями, домен HNH меняет форму и занимает положение у тёмной цепи. Каждый нуклеазный домен режет свою цепь. HNH режет спаренную с направляющей, RuvC режет вытесненную серую. Оба разреза находятся за 3 пары оснований до PAM, на одном уровне, поэтому концы обычно тупые, а не ступенчатые.

Здесь разрез проходит между парами оснований 27 и 28 при счёте слева. Со стороны PAM остаются три пары мишени. На месте разреза вспыхивает жёлтое кольцо. Затем Cas9 поднимается, и концы расходятся.

Если отключить один домен, Cas9 разрезает лишь одну цепь. Такую никазу используют с двумя направляющими к близким участкам противоположных цепей. Двойной разрыв возникает только там, где подходят обе направляющие.

Что клетка делает со сломанной хромосомой

Cas9 лишь создаёт разрыв. Само редактирование выполняют системы репарации клетки, постоянно устраняющие повреждения ДНК. Есть два основных пути.

Первый, негомологичное соединение концов, называется NHEJ. Клетка склеивает концы, обычно добавляя или теряя несколько оснований в месте соединения. Внутри гена изменение на одно или два основания сдвигает рамку считывания всех последующих кодонов, и ген часто перестаёт давать свой белок. Ползунок «Ход процесса» или шаг 7 экскурсии показывает соединение концов с одной дополнительной парой, отмеченной кольцом.

Второй путь, гомологически направленная репарация, называется HDR. При наличии фрагмента ДНК, совпадающего с обоими краями разрыва, клетка может использовать его как матрицу и скопировать через разрыв. Матрица с изменёнными буквами в середине позволяет внести выбранное изменение в геном. Включите «Матрица репарации»: рядом с разрывом появится зелёная матрица, и при соединении три пары оснований примут её буквы.

Проверка чисел

Почему хватает 20 букв? Для каждой позиции есть 4 варианта, поэтому последовательностей длиной 20 существует 4^20 = 1 099 511 627 776, около 1,1 × 10^12. В человеческом геноме примерно 3 × 10^9 пар оснований. Последовательность может находиться на любой цепи, значит, мест поиска около 6 × 10^9. Если бы геном был случайным, данная последовательность встречалась бы случайно около 6 × 10^9 ÷ 1,1 × 10^12 ≈ 0,005 раза. В этой случайной модели дополнительная точная копия выбранной мишени маловероятна; для реального генома это не гарантия.

С затравкой получается иначе. Десять её букв и два G в PAM фиксируют 12 букв, а 4^12 = 16 777 216. В случайной последовательности такой рисунок встречался бы около 6 × 10^9 ÷ 1,7 × 10^7 ≈ 360 раз. Cas9 иногда разрезает такие места, даже если дальний конец направляющей совпадает плохо. Поэтому перед использованием её проверяют по всему геному. Реальные геномы также полны повторов, и действительные числа хуже случайной оценки.

Длина мишени здесь 20 × 0,34 = 6,8 nm, два полных витка спирали. Разрез находится за 3 пары оснований, около 1 nm, до PAM.

Попробовать на экране

Модель начинается с поиска. Cas9 скользит вдоль короткого придуманного участка ДНК, останавливается у каждой метки NGG, и только там, где гид совпадает, двойная спираль раскрывается и разрезается. Буквы придуманы для картинки: она показывает идею, а не лабораторный метод.

• Нажмите метку NGG в строке букв на сцене. Cas9 перейдёт туда, а где гид не спаривается, отпустит ДНК и двинется дальше.
• Перетащите сам Cas9 вдоль ДНК и отпустите его на метке NGG.
• Выберите гид с одной неверной буквой рядом с PAM или выключите PAM и посмотрите, как Cas9 не режет.
• Нажимайте на части белка, чтобы прочитать, что делают домены HNH и RuvC, доля REC и домен, узнающий PAM.
• Откройте историю бактерии: она сохраняет кусочек ДНК вируса и использует его, когда вирус возвращается.
• Под элементами управления есть задания, спрятанные находки, сравнение размеров с волосом и клеткой и история CRISPR с 1987 года до первого одобренного лекарства.

Что модель не учитывает

Белок показан четырьмя объёмами, а не измеренной поверхностью, домен HNH просто перемещается между двумя точками. ДНК прямая и регулярная, ровно с 10 парами на виток, хотя настоящая ДНК изгибается там, где Cas9 захватывает её рядом с PAM. R-петля раскрывается аккуратно по одной паре; реальный процесс тоже ступенчатый, но не равномерный. После разреза Cas9 поднимается, чтобы открыть концы, но длительность связывания настоящего белка не показана.

Правило несоответствий тоже упрощено. Настоящий Cas9 допускает некоторые несовпадения вдали от PAM и может разрезать такие внецелевые участки. Для каждого пути репарации показан один пример: одна дополнительная пара при NHEJ и три изменённые при HDR. В клетках NHEJ даёт смесь небольших вставок и делеций, а не фиксированный результат. Последовательность модели вымышлена и не относится к реальному гену.

От бактериальной загадки к лабораторному инструменту

Charpentier изучала Streptococcus pyogenes и обнаружила tracrRNA, опубликовав результат в марте 2011 года. Той весной на конференции в Puerto Rico она встретила Doudna, биохимика из University of California, Berkeley. Они решили вместе изучать Cas9. В пробирке Cas9 с одной crRNA не разрезал ДНК. После добавления tracrRNA разрез происходил. Затем исследователи объединили РНК в одну направляющую и показали, что изменение её последовательности позволяет выбирать места разреза. Статья вышла в 2012 году. В начале 2013 года другие группы показали редактирование геномов клеток человека и мыши.

Royal Swedish Academy of Sciences присудила Нобелевскую премию по химии 2020 года Emmanuelle Charpentier и Jennifer A. Doudna «за разработку метода редактирования генома».

Где это используется

По данным Nobel Committee, CRISPR-Cas9 стал обычным инструментом фундаментальных исследований: изменяя гены в клетках и лабораторных животных, выясняют их функции. Он применяется и в селекции растений; комитет приводит пример риса, отредактированного для меньшего поглощения кадмия и мышьяка из почвы. MedlinePlus из US National Library of Medicine отмечает исследования и клинические испытания редактирования генома при многих болезнях, а также то, что редактирование яйцеклеток, сперматозоидов или эмбрионов сейчас незаконно в США и многих других странах.

В Европейском союзе разрешён один препарат, созданный с CRISPR-Cas9. European Medicines Agency выдало Casgevy (exagamglogene autotemcel) условное разрешение на продажу 9 февраля 2024 года для пациентов от 12 лет с трансфузионно-зависимой бета-талассемией или тяжёлой серповидноклеточной болезнью. Препарат делают из собственных стволовых клеток крови пациента, отредактированных вне организма для усиленного образования фетального гемоглобина. Условное разрешение требует от компании дополнительных доказательств после одобрения. Экспонат не утверждает, насколько эффективно или безопасно какое-либо лечение; подробности есть на странице агентства.

Почему уникальный адрес не исключает внецелевых разрезов

Случайная оценка выше считает точные совпадения, но не всё, что способен принять фермент. Допустим одну неверную букву в направляющей из 20 оснований. Есть 20 позиций и по 3 альтернативы в каждой, то есть 20 × 3 = 60 соседних последовательностей с одним несовпадением. Вместе с точной последовательностью получается 61 вариант. Для условного генома из 3 200 000 000 пар оснований обе цепи дают около 6 400 000 000 возможных начальных позиций. При заведомо нереалистичном допущении независимых равновероятных оснований ожидаемое число точных совпадений равно 6 400 000 000 ÷ 4^20 ≈ 0,0058. Учёт точной последовательности и 60 соседних повышает ожидание примерно до 0,36 без требования PAM.

В NGG буква N произвольна, а вероятность каждого G в условном геноме равна 1/4. Требование NGG умножает ожидания на 1/16. Для 61 варианта получается около 0,022. Это ожидаемые количества случайных рисунков последовательности, а не проценты клинического риска или измеренные частоты разрезания. Намеренная мишень не учитывается: её выбрали потому, что она существует. Расчёт также не означает, что любое допустимое несовпадение ведёт к разрезу. Повторы, неодинаковые частоты оснований, упаковка ДНК, варианты пациента и положения ошибок нарушают допущения. Дублированный ген может дать почти идентичную мишень даже при низкой случайной оценке.

Поэтому проектирование направляющей начинается с поиска по соответствующему геному и продолжается экспериментами. Предсказанный внецелевой участок требует проверки, но не доказывает повреждения; отсутствие обнаруженного разреза тоже ограничено чувствительностью метода. В 2016 году Kleinstiver и коллеги описали SpCas9-HF1 с ослабленными неспецифическими контактами с ДНК. Он сохранял высокую активность для многих проверенных направляющих, уменьшая обнаруживаемую внецелевую активность. Слова «не обнаружено» в заголовке относятся к этим испытаниям, а не ко всем клеткам и направляющим. Высокоточный фермент может терять полезную активность на некоторых мишенях, поэтому специфичность проверяют вместе с эффективностью. Правило модели, где любая ошибка останавливает разрезание, служит учебным упрощением, а не симуляцией этого белка.

Изменение букв без двухцепочечного разрыва

Переключатель матрицы здесь показывает HDR после разрыва, но не все виды точного редактирования. В 2016 году Komor и коллеги описали редактор оснований, объединивший направляемый к ДНК компонент Cas9 с цитидиндезаминазой. Она превращает цитидин в уридин в раскрытой ДНК. Последующая обработка может дать замену C на T, или G на A при описании по противоположной цепи. Поздние конструкции используют никазу, разрезающую одну цепь, для предпочтительного получения нужного результата. Отказ от намеренного двухцепочечного разрыва не означает полного отсутствия одноцепочечных надрезов или нежелательных продуктов.

Редактор оснований действует в окне редактирования, а не меняет любую выбранную букву где угодно рядом с направляющей. Другие доступные основания в этом окне тоже могут измениться, давая сопутствующие изменения. Наличие PAM по-прежнему ограничивает места связывания. Доставка в нужные клетки, нежелательное редактирование в других местах и доля клеток с нужным изменением требуют экспериментов. Редактор полезен, если его химическое превращение соответствует необходимой замене; это не универсальная проверка орфографии генома.

Прайм-редактирование, описанное Anzalone и коллегами в 2019 году, использует никазу Cas9, связанную с обратной транскриптазой. Удлинённая направляющая pegRNA одновременно указывает мишень и несёт матрицу с предлагаемым изменением. Фермент копирует информацию из РНК в ДНК, после чего клетка должна обработать промежуточную структуру. Это позволяет делать замены и небольшие вставки или делеции без отдельной донорной ДНК и намеренного двухцепочечного разрыва. Однако метод зависит от репарации, а эффективность и нежелательные продукты от мишени и конструкции. Ни редактирование оснований, ни прайм-редактирование здесь не показаны. Зелёная «Матрица репарации» есть ДНК для HDR, а не pegRNA, и разрез обеих цепей относится к обычному редактированию Cas9.

Что Casgevy меняет в клетках пациента

Casgevy даёт конкретный пример редактирования вне организма. Британское MHRA объявило о разрешении 16 ноября 2023 года; само решение датировано в объявлении 15 ноября. 8 декабря 2023 года US FDA одобрило Casgevy для пациентов от 12 лет с серповидноклеточной болезнью и повторяющимися вазоокклюзионными кризами. Показания и условия доступа следует читать у каждого регулятора, не предполагая их одинаковыми в разных странах. Эти даты относятся к первым решениям, а не ко всему списку последующих разрешений.

При серповидноклеточной болезни аномальный взрослый гемоглобин может делать эритроциты жёсткими, серповидными и перекрывающими кровоток. Casgevy не заменяет непосредственно серповидную мутацию во всех клетках организма. У пациента собирают кроветворные стволовые клетки, редактируют их CRISPR-Cas9 вне тела и возвращают инфузией. Изменение затрагивает регуляцию фетального гемоглобина, позволяя эритроцитарным потомкам обработанных клеток производить его больше. Фетальный гемоглобин может уменьшать серповидность при сохранении исходной наследственной мутации. Так изменение регулятора компенсирует болезнь без исправления исходной последовательности ДНК.

Инфузия составляет лишь часть сложного лечения. FDA объясняет, что сначала пациент получает высокодозную химиотерапию для подготовки костного мозга к изменённым клеткам. Сбор, изготовление, подготовка, приживление и наблюдение важны для результата; одной направляющей лечение не исчерпывается. Собственные клетки не устраняют риски химиотерапии или необходимость длительного наблюдения. Это соматическое лечение: отредактированные кроветворные клетки не становятся яйцеклетками или сперматозоидами, и передача изменения детям не предусмотрена. Модель показывает распознавание, разрез и репарацию одной вымышленной мишени. Она не моделирует мишень Casgevy, клиническое производство, отбор пациентов или вероятность пользы для конкретного человека.

Чего экран не решает о наследуемом редактировании

Редактирование стволовой клетки крови и эмбриона поднимает разные вопросы. Изменение эмбриона может попасть в ткани всего развивающегося человека, включая будущие предшественники яйцеклеток или сперматозоидов. Тогда его унаследуют потомки, не имевшие возможности согласиться. При изменении лишь части ранних клеток человек может оказаться мозаиком с разными изменениями ДНК в разных клеточных популяциях. Чистая последовательность одного образца не доказывает одинаковость всех тканей. Даже идеально расположенное изменение не устанавливает медицинскую оправданность применения или справедливость доступа.

Рекомендации WHO 2021 года различают соматическое, герминальное и наследуемое редактирование и призывают к надзору, реестрам, международному сотрудничеству и способам сообщать о незаконных, незарегистрированных, неэтичных или небезопасных исследованиях. Это рамки контроля, а не международное разрешение и не закон, автоматически заменяющий национальные правила. Нобелевская премия 2020 года отметила разработку метода Charpentier и Doudna, но научная награда не одобряет любое его применение.

Используйте экран, чтобы отличать молекулярное наблюдение от широкого вывода. Включите «Совпадение» и «PAM (NGG)», затем проведите «Ход процесса» через разрез и репарацию. Повторите с отключённым PAM, не меняя направляющую: одного совпадающего адреса недостаточно. Верните PAM и сравните «Ошибка в затравке» с «Дальняя ошибка». Обе останавливают разрезание, но на разных стадиях спаривания; это не доказательство равных биологических рисков. Наконец сравните репарацию с матрицей и без неё. Показанные продукты иллюстрируют два пути, но не их частоты в клетках. Для каждого опыта запишите наличие PAM, место остановки спаривания и продукт репарации. Ни одно наблюдение не измеряет безопасность лечения, жизнеспособность эмбриона или согласие.