CRISPR-Cas9 interactif : coupe et réparation de l’ADN

Comment une protéine trouve-t-elle un seul endroit dans tout un génome ?

Une copie du génome humain compte environ 3 milliards de paires de bases. Imaginons que vous vouliez modifier un seul gène. Il vous faut un outil capable de lire l’ADN, de reconnaître un court segment et de le couper précisément là, sans toucher à aucun autre segment. Les outils précédents, les nucléases à doigts de zinc et les TALEN, exigeaient une protéine conçue sur mesure pour chaque cible, et concevoir une protéine est lent et difficile. CRISPR-Cas9 a changé la donne. La protéine reste la même, et seul un court ARN guide est réécrit.

Cette exposition construit le système à l’échelle moléculaire. Un court morceau d’ADN traverse la scène, et Cas9 arrive en tenant son ARN guide. Vous pouvez la suivre pendant qu’elle trouve un PAM, apparie le guide à 20 bases d’ADN, coupe les deux brins et laisse la cellule réparer la cassure. Au-dessus du modèle se trouve une case où vous pouvez taper votre propre guide. Si les lettres ne correspondent pas, le guide cesse de s’apparier et rien n’est coupé. Les chiffres viennent du comité Nobel de chimie, d’OpenStax, de la Protein Data Bank du RCSB et du National Human Genome Research Institute américain. Les sources sont listées à la fin.

L’ADN à l’échelle du modèle

L’ADN est formé de deux brins enroulés l’un autour de l’autre. Chaque brin est une chaîne de sucres et de phosphates, et chaque sucre porte l’une des quatre bases : A, C, G ou T. Le A d’un brin s’apparie avec le T de l’autre, et le C avec le G, si bien que chaque brin peut se déduire de son partenaire. Dans le modèle, les bases sont colorées ainsi : A vert, T rouge, G jaune et C bleu. La base U de l’ARN, qui y remplace le T, est violette.

La forme courante de l’ADN, l’ADN B, a des dimensions fixes. La double hélice fait 2 nm de large. Deux paires de bases voisines sont distantes de 0,34 nm, et l’hélice fait un tour complet tous les 3,4 nm, soit toutes les 10 paires de bases. Les barres noires à l’extrémité gauche du modèle montrent la largeur de 2 nm et un tour de 3,4 nm. Le modèle compte 44 paires de bases ; il mesure donc 44 × 0,34 = 15 nm de long.

Les deux brins vont en sens opposés. Les chimistes notent les extrémités 5′ et 3′, et les séquences s’écrivent de 5′ vers 3′. Dans le modèle, le brin gris va de 5′ à 3′ de gauche à droite et le brin foncé dans l’autre sens. Le brin gris porte les mêmes lettres que le guide (avec T là où le guide a U), et le brin foncé est celui auquel le guide s’apparie.

Une mémoire bactérienne des virus

CRISPR a commencé comme une énigme dans les génomes bactériens. En 1987, des chercheurs ont remarqué un motif étrange dans l’ADN d’Escherichia coli : cinq copies d’une séquence de 29 paires de bases, séparées par 32 paires de bases d’une séquence différente à chaque fois. Des ensembles semblables sont apparus chez de nombreuses bactéries et archées, et on leur a donné le nom de CRISPR, sigle anglais de « courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacées ». À côté se trouvait un groupe de gènes, appelés cas pour « associés à CRISPR », qui codaient des protéines ressemblant à des enzymes qui déroulent et coupent les acides nucléiques.

En 2005, trois équipes ont rapporté que les espaceurs situés entre les répétitions correspondaient à l’ADN de virus et de plasmides. Les bactéries qui portaient un espaceur donné étaient rarement infectées par un virus de séquence correspondante. En 2007, une expérience sur Streptococcus thermophilus a montré le lien directement. Les bactéries qui avaient survécu à l’attaque d’un virus avaient acquis de nouveaux espaceurs copiés sur ce virus, et lui résistaient désormais. Retirer l’espaceur supprimait la résistance.

Le locus CRISPR fonctionne donc comme un registre des infections passées. Il est copié en un long ARN, découpé en courts ARN CRISPR, un par espaceur. Chaque ARN court s’associe à des protéines Cas et les conduit vers l’ADN de séquence correspondante. Le système de Streptococcus n’a besoin que d’une protéine pour couper, Cas9, avec un second petit ARN, le tracrRNA, que l’équipe d’Emmanuelle Charpentier a décrit en 2011.

Cas9 et son ARN guide

La Cas9 de Streptococcus pyogenes est une grosse protéine. La chaîne de la structure cristalline 4OO8 de la Protein Data Bank compte 1372 acides aminés et pèse environ 159 kilodaltons. Cette structure, résolue à 2,5 Å en 2014, a révélé deux lobes. Le lobe de reconnaissance (REC) tient l’ARN guide et la paire ARN-ADN. Le lobe nucléase contient les deux domaines de coupure, HNH et RuvC, et un domaine d’interaction avec le PAM près de son extrémité.

Dans le modèle, la protéine est dessinée sous forme de quatre masses souples à ces emplacements. Les formes sont inventées et transparentes pour que vous puissiez suivre l’ARN et l’ADN à l’intérieur. Activez « Voir à l’intérieur » dans l’onglet « Réglages » pour les rendre plus pâles encore.

Chez les bactéries, Cas9 porte deux ARN : le crRNA, avec l’espaceur, et le tracrRNA, qui le maintient en place. En 2012, Charpentier, Jennifer Doudna et leurs collègues les ont réunis en un seul ARN guide. Le guide a deux parties. Les 20 premières lettres, l’espaceur, choisissent la cible. Le reste se replie en un échafaudage logé dans la protéine, dessiné comme un tube orange dans le modèle. Changez les 20 lettres et la même protéine ira ailleurs.

Première étape : trouver un PAM

Cas9 ne compare pas chaque segment d’ADN à son guide. Elle cherche d’abord un motif adjacent au protoespaceur, ou PAM. Pour la Cas9 de S. pyogenes, c’est NGG sur le brin gris, juste après la cible : une base quelconque, puis deux G. Deux arginines du domaine d’interaction avec le PAM reconnaissent les GG par des liaisons hydrogène. Ce n’est qu’après avoir trouvé un PAM que la protéine courbe l’ADN à côté et commence à écarter les brins.

Le PAM répond aussi à une question sur les bactéries. Si l’espaceur correspond à l’ADN du virus, il correspond aussi à sa propre copie dans le locus CRISPR. La bactérie évite de couper son propre génome parce que les espaceurs du locus ne sont pas à côté d’un PAM, alors que la séquence correspondante du virus l’est.

Dans le modèle, le PAM est TGG. Désactivez « PAM (NGG) » dans l’onglet « Réglages » et il devient TGA. Cas9 survole alors l’ADN et s’éloigne sans l’ouvrir, même si le guide correspond toujours aux 20 bases.

Deuxième étape : vingt lettres, en commençant par la graine

À côté du PAM, l’ADN s’ouvre paire de bases par paire de bases et l’ARN guide s’apparie au brin foncé. Le brin gris est repoussé en boucle. Cette structure, où l’ARN est apparié à un brin d’ADN et l’autre brin est déplacé, s’appelle une boucle R. L’appariement commence du côté du PAM, et les 10 bases du guide les plus proches du PAM, la graine, comptent le plus. Un mésappariement dans la graine arrête en général la reconnaissance.

La case au-dessus du modèle montre la cible sur le brin gris, de 5′ vers 3′, avec le PAM au bout. Les 10 positions de la graine sont teintées. En dessous se trouve le guide. Tapez dans la case ou utilisez les quatre boutons :

• « Identique » : les 20 lettres s’apparient. La boucle R atteint l’extrémité lointaine et Cas9 coupe.
• « Erreur dans la graine » : la position 17 est modifiée. La boucle R ouvre 3 paires de bases et s’arrête.
• « Erreur lointaine » : la position 3 est modifiée. La boucle R ouvre 17 paires de bases, puis se referme.
• « Autre gène » : un guide écrit pour une autre séquence. Rien ne s’apparie.

Les lettres non appariées apparaissent en noir. Dans le modèle, tout mésappariement arrête l’appariement à cette lettre, l’ADN se referme et Cas9 lâche prise. La vraie Cas9 est moins stricte, comme l’expliquent les sections suivantes.

Troisième étape : deux domaines, deux coupures

Quand le guide s’est apparié sur les 20 bases, le domaine HNH change de forme et pivote contre le brin foncé. Chaque domaine nucléase coupe un brin. HNH coupe le brin apparié au guide, et RuvC le brin gris déplacé. Les deux coupures tombent 3 paires de bases avant le PAM, à la même position sur les deux brins, si bien que les deux extrémités sont en général franches plutôt que décalées.

Dans le modèle, la coupure tombe entre les paires de bases 27 et 28, en comptant depuis la gauche, et laisse trois paires de bases de la cible du côté du PAM. Un anneau jaune clignote à la coupure. Puis Cas9 s’éloigne et les deux extrémités s’écartent.

Si l’un des deux domaines est désactivé, Cas9 ne coupe qu’un brin. Cette nickase s’utilise avec deux guides qui visent des brins opposés tout proches, ce qui ne produit une cassure que là où les deux guides correspondent.

Ce que fait la cellule d’un chromosome cassé

Cas9 ne fait que la cassure. La modification proprement dite est réalisée par les systèmes de réparation de la cellule, qui s’occupent sans cesse d’ADN cassé. Il existe deux voies principales.

La première est la jonction d’extrémités non homologues, ou NHEJ. La cellule recolle les deux extrémités. Cela ajoute ou retire en général quelques bases à la jonction. Dans un gène, un changement d’une ou deux bases décale le cadre de lecture de tous les codons suivants, et le gène cesse souvent de produire sa protéine. Utilisez le curseur « Avancement » ou l’étape 7 de la visite pour voir le modèle rejoindre les extrémités avec une paire de bases en plus, marquée par un anneau.

La seconde est la réparation dirigée par homologie, ou HDR. Si un morceau d’ADN correspondant aux deux côtés de la cassure est présent, la cellule peut s’en servir comme matrice et le recopier dans la brèche. En fournissant une matrice dont les lettres du milieu sont modifiées, les chercheurs peuvent écrire une modification choisie dans le génome. Activez « Matrice de réparation » et la matrice verte apparaît près de la cassure ; quand les extrémités se rejoignent, trois paires de bases au niveau de la coupure prennent les lettres de la matrice.

Vérifier les chiffres

Pourquoi 20 lettres suffisent-elles ? Il y a 4 choix à chaque position, donc 4^20 = 1 099 511 627 776 séquences différentes de 20 lettres, environ 1,1 × 10^12. Un génome humain compte environ 3 × 10^9 paires de bases, et une séquence peut se trouver sur l’un ou l’autre brin, ce qui fait environ 6 × 10^9 endroits où chercher. Si le génome était aléatoire, une séquence donnée de 20 lettres apparaîtrait par hasard environ 6 × 10^9 ÷ 1,1 × 10^12 ≈ 0,005 fois. Dans ce modèle aléatoire, une copie exacte supplémentaire est peu probable ; ce n’est pas une garantie pour un génome réel.

La graine raconte une autre histoire. Les dix lettres de la graine plus les deux G du PAM fixent 12 lettres, et 4^12 = 16 777 216. Une séquence aléatoire contiendrait ce motif environ 6 × 10^9 ÷ 1,7 × 10^7 ≈ 360 fois. Cas9 peut parfois couper de tels sites même quand l’extrémité lointaine du guide correspond mal ; c’est pourquoi les séquences guides sont comparées à tout le génome avant usage. Les vrais génomes sont en outre pleins de séquences répétées, si bien que les vrais chiffres sont pires que l’estimation aléatoire.

Dans le modèle, la cible mesure 20 × 0,34 = 6,8 nm de long, soit deux tours complets de l’hélice. La coupure se trouve à 3 paires de bases du PAM, environ 1 nm.

L’essayer à l’écran

Le modèle commence par la recherche. Cas9 glisse le long d’un court morceau d’ADN inventé, s’arrête à chaque marque NGG, et ce n’est que là où le guide correspond que la double hélice s’ouvre et est coupée. Les lettres sont inventées pour l’image : elle montre l’idée, pas une méthode de laboratoire.

• Appuyez sur une marque NGG dans la ligne de lettres sur la scène. Cas9 y va et, là où le guide ne s’apparie pas, il lâche prise et passe à la suite.
• Faites glisser Cas9 lui-même le long de l’ADN et déposez-le sur une marque NGG.
• Choisissez un guide avec une lettre fausse près du PAM, ou désactivez le PAM, et regardez Cas9 échouer à couper.
• Appuyez sur les parties de la protéine pour lire ce que font les domaines HNH et RuvC, le lobe REC et le domaine qui reconnaît le PAM.
• Ouvrez l’histoire de la bactérie pour voir comment elle garde un morceau d’ADN de virus et s’en sert quand le virus revient.
• Sous les commandes, il y a des défis, des choses cachées, une comparaison de taille avec un cheveu et une cellule, et une histoire de CRISPR de 1987 au premier médicament autorisé.

Ce que le modèle laisse de côté

La protéine se résume à quatre masses, et non à la surface mesurée, et le domaine HNH glisse simplement d’un endroit à un autre. L’ADN est une hélice droite et régulière d’exactement 10 paires de bases par tour, alors que le vrai ADN est coudé là où Cas9 le saisit près du PAM. La boucle R s’ouvre proprement paire de bases par paire de bases ; le vrai processus progresse aussi par étapes, mais pas à un rythme régulier. Cas9 s’éloigne après la coupure pour que vous voyiez les extrémités, et le modèle ne montre pas combien de temps la vraie protéine reste fixée.

La règle des mésappariements est elle aussi plus simple que la réalité. La vraie Cas9 tolère certains mésappariements loin du PAM et peut couper de tels sites hors cible. La réparation ne montre qu’un exemple de chaque voie : une paire de bases en plus pour NHEJ et trois paires de bases modifiées pour HDR. Dans les cellules, NHEJ donne un mélange de petites insertions et délétions plutôt qu’un résultat fixe. La séquence du modèle est inventée et n’appartient à aucun gène réel.

D’une énigme bactérienne à un outil de laboratoire

Charpentier étudiait Streptococcus pyogenes et a découvert le tracrRNA, publié en mars 2011. Ce printemps-là, elle a rencontré Doudna, biochimiste à l’université de Californie à Berkeley, lors d’un congrès à Porto Rico, et elles ont décidé de travailler ensemble sur Cas9. En tube à essai, Cas9 avec le seul crRNA ne coupait pas l’ADN. Quand elles ont ajouté le tracrRNA, l’ADN a été coupé. Elles ont ensuite fusionné les deux ARN en un seul guide et montré qu’en changeant sa séquence, elles pouvaient couper l’ADN aux endroits de leur choix. L’article est paru en 2012. Début 2013, d’autres équipes ont montré que le système modifie des génomes dans des cellules humaines et de souris.

L’Académie royale des sciences de Suède a décerné le prix Nobel de chimie 2020 à Emmanuelle Charpentier et Jennifer A. Doudna « pour la mise au point d’une méthode d’édition du génome ».

Où on l’utilise

Selon le comité Nobel, CRISPR-Cas9 est aujourd’hui un outil courant de la recherche fondamentale, où il sert à modifier des gènes dans des cellules et des animaux de laboratoire pour découvrir leur rôle. Il est aussi utilisé en amélioration des plantes ; le résumé du comité cite l’exemple de variétés de riz modifiées pour absorber moins de cadmium et d’arsenic du sol. MedlinePlus, de la National Library of Medicine américaine, indique que l’édition du génome est étudiée en recherche et en essais cliniques pour de nombreuses maladies, et que modifier des ovules, des spermatozoïdes ou des embryons est actuellement illégal aux États-Unis et dans beaucoup d’autres pays.

Un médicament fabriqué avec CRISPR-Cas9 a été autorisé dans l’Union européenne. L’Agence européenne des médicaments a accordé à Casgevy (exagamglogène autotemcel) une autorisation de mise sur le marché conditionnelle le 9 février 2024 pour les personnes de 12 ans et plus atteintes de bêta-thalassémie dépendante des transfusions ou de drépanocytose sévère. Il est fabriqué à partir des propres cellules souches sanguines du patient, modifiées hors du corps pour qu’elles produisent davantage d’hémoglobine fœtale. Une autorisation conditionnelle signifie que l’entreprise doit fournir des preuves supplémentaires après l’autorisation. Cette exposition n’affirme rien sur l’efficacité ou la sécurité d’un traitement ; la page de l’agence donne les détails.

Pourquoi une adresse unique n'empêche pas les coupures hors cible

Le calcul aléatoire précédent compte les correspondances exactes, pas tout ce que l'enzyme accepte. Avec une lettre incorrecte dans un guide de 20 bases, il existe 20 positions et 3 alternatives par position : 20 × 3 = 60 séquences voisines, soit 61 avec l'originale. Un génome illustratif de 3 200 000 000 paires de bases offre environ 6 400 000 000 positions de départ sur les deux brins. Avec des bases indépendantes et équiprobables, on attend 6 400 000 000 ÷ 4^20 ≈ 0,0058 correspondance exacte accidentelle. Avec les 60 voisines, on atteint environ 0,36 avant d'exiger un PAM.

Dans NGG, N désigne toute base et chaque G a une probabilité de 1/4 dans ce génome fictif. Exiger NGG multiplie donc l'espérance par 1/16 : environ 0,022 pour les 61 séquences. Ce sont des nombres attendus de motifs accidentels, pas des pourcentages de risque clinique ou des taux de coupure mesurés. La cible voulue, choisie parce qu'elle existe, n'y est pas incluse. Toutes les séquences tolérées ne sont pas nécessairement coupées. Répétitions, fréquences inégales, empaquetage de l'ADN, variants du patient et position des erreurs invalident les hypothèses. Un gène dupliqué peut fournir une cible presque identique malgré une faible prédiction aléatoire.

La conception commence donc par une recherche dans le génome pertinent, puis se poursuit avec des mesures expérimentales. Un site hors cible prédit est un candidat à examiner, pas une lésion prouvée ; l'absence de détection dépend aussi de la sensibilité du test. En 2016, Kleinstiver et ses collègues ont décrit SpCas9-HF1, dont les contacts non spécifiques avec l'ADN sont affaiblis. L'activité sur cible restait élevée avec beaucoup de guides testés et l'activité indésirable détectable diminuait. « Non détectable » vaut pour ces essais, pas pour toutes les cellules et tous les guides. La haute fidélité peut diminuer l'activité souhaitée sur certaines cibles : spécificité et efficacité se mesurent ensemble. L'arrêt systématique au moindre défaut est une simplification pédagogique, pas une simulation de cette protéine modifiée.

Changer des lettres sans casser les deux brins

Le réglage du modèle représente la HDR après une cassure, pas toutes les éditions précises. En 2016, Komor et ses collègues ont associé un composant Cas9 ciblant l'ADN à une cytidine désaminase. Celle-ci transforme la cytidine en uridine dans l'ADN exposé ; le traitement ultérieur peut donner C vers T, ou G vers A depuis le brin opposé. Des versions ultérieures emploient une nickase coupant un brin pour favoriser le résultat. Éviter une cassure volontaire des deux brins ne signifie ni absence d'entailles simples ni absence de produits indésirables.

Un éditeur de bases agit dans une fenêtre d'édition, pas sur n'importe quelle lettre voisine du guide. D'autres bases modifiables dans cette fenêtre peuvent subir des modifications collatérales. Le PAM limite toujours les positions de liaison. L'acheminement vers les bonnes cellules, les modifications ailleurs et la proportion de cellules correctement éditées restent à mesurer. La méthode convient quand sa conversion chimique correspond au changement nécessaire ; ce n'est pas un correcteur universel du génome.

L'édition prime, décrite par Anzalone et ses collègues en 2019, relie une nickase Cas9 à une transcriptase inverse. L'ARN guide allongé, pegRNA, indique la cible et porte le modèle de la modification. L'enzyme copie l'information de l'ARN en ADN, puis la cellule résout l'intermédiaire. Des substitutions, petites insertions et délétions sont ainsi possibles sans ADN donneur séparé ni cassure volontaire des deux brins. La réparation cellulaire reste nécessaire ; efficacité et produits indésirables dépendent de la cible et de la conception. Aucune de ces méthodes n'est animée ici. L'objet vert représente de l'ADN pour la HDR, pas un pegRNA ; la coupure des deux brins correspond au Cas9 classique.

Ce que Casgevy change dans les cellules du patient

Casgevy illustre une édition hors du corps. La MHRA britannique a annoncé l'autorisation le 16 novembre 2023 ; son communiqué date la décision du 15 novembre. La FDA américaine a approuvé Casgevy le 8 décembre 2023 pour les patients de 12 ans et plus atteints de drépanocytose avec crises vaso-occlusives récurrentes. Indications et conditions d'accès doivent être lues auprès de chaque autorité, sans les supposer identiques entre pays. Ces dates concernent les décisions initiales, pas toutes les autorisations ultérieures.

L'hémoglobine adulte anormale peut rigidifier les globules rouges en faucille et gêner la circulation. Casgevy ne remplace pas directement la mutation dans toutes les cellules. Des cellules souches hématopoïétiques du patient sont prélevées, éditées par CRISPR-Cas9 hors du corps et réinjectées. L'édition modifie la régulation de l'hémoglobine fœtale afin que les descendants érythroïdes en produisent davantage. Cette hémoglobine peut réduire la falciformation malgré la persistance de la mutation héritée. Modifier un régulateur peut compenser une maladie sans réparer sa lettre d'origine.

La perfusion n'est qu'une étape d'un traitement exigeant. La FDA explique qu'une chimiothérapie à forte dose prépare d'abord la moelle osseuse. Prélèvement, fabrication, conditionnement, prise de greffe et suivi influencent le résultat ; la séquence du guide n'est pas à elle seule le traitement. Employer ses propres cellules ne supprime ni les risques de chimiothérapie ni la surveillance prolongée des cellules éditées. C'est un traitement somatique : ces cellules ne deviennent pas des ovules ou spermatozoïdes et la transmission aux enfants n'est pas recherchée. Le modèle utilise une cible inventée et ne représente ni celle de Casgevy, ni la fabrication clinique, l'éligibilité ou le bénéfice individuel probable.

Ce que l'écran ne décide pas sur l'édition héréditaire

Éditer une cellule souche sanguine et un embryon soulève des questions différentes. L'édition embryonnaire pourrait atteindre de nombreux tissus, dont les cellules produisant plus tard les gamètes, puis se transmettre à des descendants qui n'ont pas pu consentir. Si seules certaines cellules précoces sont éditées, un mosaïcisme peut apparaître, avec des modifications différentes selon les populations cellulaires. Une séquence apparemment nette dans un prélèvement ne prouve pas l'uniformité de tous les tissus. Même une modification bien placée ne démontre ni justification médicale ni accès équitable.

Les recommandations de l'OMS de 2021 distinguent édition somatique, germinale et héréditaire. Elles demandent surveillance, registres, coopération internationale et signalement des recherches illégales, non enregistrées, contraires à l'éthique ou dangereuses. Il s'agit d'un cadre de gouvernance, pas d'un permis mondial ni d'une loi remplaçant automatiquement les règles nationales. Le Nobel de chimie de 2020 récompensait le développement de la méthode par Charpentier et Doudna, pas toutes ses applications.

À l'écran, commencez avec « Identique » et PAM (NGG) activé, puis avancez jusqu'à la coupure et la réparation. Désactivez PAM sans changer le guide : la bonne adresse ne suffit pas. Rétablissez-le et comparez « Erreur dans la graine » et « Erreur lointaine ». Les deux empêchent ici la coupure mais arrêtent l'appariement à des endroits différents ; cela ne prouve pas des risques biologiques égaux. Comparez ensuite la réparation avec et sans modèle : ce sont des exemples de voies, pas des fréquences cellulaires. Notez présence du PAM, point d'arrêt et produit obtenu. Rien de cela ne mesure la sécurité thérapeutique, la viabilité embryonnaire ou le consentement.