ATP sintase: explore como funciona seu rotor molecular

De onde vem o ATP de uma célula?

Como funciona a ATP sintase? Prótons que voltam por uma membrana fazem girar um anel dentro dela, como uma roda-d’água, e a haste que gira aperta um após o outro os três sítios catalíticos da cabeça, unindo ADP e fosfato em ATP. Funcionando ao contrário, a mesma enzima quebra ATP e bombeia prótons, e por isso também é chamada de ATPase.

Músculos, nervos e as enzimas que copiam o DNA funcionam todos com o mesmo combustível, a adenosina trifosfato. Quando se retira o terceiro fosfato, a energia liberada realiza o trabalho; quando ele é recolocado, a molécula fica pronta de novo. As quantidades são grandes. Segundo o Comitê Nobel, um adulto em repouso renova por dia cerca de metade do próprio peso em ATP, e num esforço intenso esse valor pode chegar perto de uma tonelada. A célula guarda apenas um pequeno estoque, então o ATP precisa ser refeito tão depressa quanto é gasto.

Quase todo esse trabalho de reconstrução é feito por uma única enzima, a ATP sintase. Ela fica na membrana interna das mitocôndrias, nas membranas das bactérias e nos tilacoides dos cloroplastos. É também uma das poucas proteínas que funcionam girando. Esta exposição monta uma versão simplificada dela em escala molecular e depois a acompanha em outros cinco lugares: uma dobra da membrana mitocondrial com a cadeia respiratória, uma membrana de cloroplasto sob luz, uma bactéria nadando, um lisossomo em que uma bomba aparentada funciona à custa de ATP e a lâmina de vidro do experimento de 1997, que mostrou pela primeira vez o rotor girando. A barra na parte de baixo do palco alterna entre as seis cenas.

Uma barragem feita de membrana

A energia não vem diretamente do alimento. A respiração faz os elétrons do alimento descerem por uma cadeia de proteínas da membrana, e essa cadeia usa a energia deles para bombear prótons para fora da matriz (o interior da mitocôndria), no espaço estreito entre as duas membranas. Os prótons se acumulam de um lado. O resultado é uma diferença de concentração e de carga elétrica através da membrana, e as duas juntas formam a chamada força próton-motriz.

Peter Mitchell propôs essa ideia quimiosmótica em 1961 e recebeu por ela o Prêmio Nobel de Química em 1978. Ela significa que a célula guarda energia como uma barragem: como uma diferença de nível que tende a se igualar. A ATP sintase é a turbina da barragem. Os prótons só podem voltar para a matriz passando por ela e, ao passar, giram seu rotor.

No modelo, os prótons são as esferas vermelhas. Os dois controles "Potencial de membrana Δψ" e "Diferença de pH ΔpH" definem a força do empurrão. Se você mexer em qualquer um deles, a multidão sob a membrana aumenta ou diminui, e o rotor acelera, desacelera, para ou gira no sentido contrário.

Somar a força próton-motriz

Um próton fora da matriz é empurrado para dentro por dois motivos. A matriz é negativa em relação ao exterior e tem menos prótons, portanto seu pH é mais alto. Mitchell escreveu o empurrão total como um único número, a força próton-motriz Δp, em milivolts:

Δp = Δψ − 59 × ΔpH

Aqui Δψ é o potencial elétrico da matriz menos o do exterior, e ΔpH é o pH da matriz menos o do exterior. Numa mitocôndria em funcionamento, Δψ é negativo e ΔpH é positivo; assim, os dois termos tornam Δp mais negativo, e quanto mais negativo ele é, mais forte é o empurrão dos prótons para dentro. O fator 59 converte uma unidade de pH em milivolts: é ln 10 × RT/F, que dá 59,16 mV a 25 °C e 61,5 mV na temperatura do corpo, 37 °C. O modelo usa 59.

Com os controles nos valores iniciais, Δψ é −150 mV e ΔpH é 0,80, de modo que Δp = −150 − 59 × 0,80 = −197 mV. O painel de leitura escreve essa soma toda vez que você move um controle. Brand e Nicholls dão 150 a 180 mV como valores típicos do potencial de membrana de mitocôndrias em células; nas mitocôndrias, a maior parte do empurrão é elétrica. Nos cloroplastos acontece o contrário, e sob luz forte a maior parte fica armazenada como diferença de pH através da membrana do tilacoide.

O que importa para a enzima é a energia que cada próton traz. Um mol de prótons atravessando 197 mV libera F × Δp = 96.485 × 0,197 ≈ 19 kJ. O restante da exposição volta a esse número várias vezes.

Fo, a parte da membrana

A enzima tem duas metades com nomes históricos. Fo, de fator sensível à oligomicina, é a parte que fica na membrana. F1, fator 1, é o botão que se projeta para dentro da matriz. O grupo de Efraim Racker isolou a enzima completa de mitocôndrias em 1960.

A parte móvel de Fo é o anel c, um anel de pequenas proteínas idênticas. Cada subunidade c é um grampo de duas hélices, e a meia altura da hélice externa há uma cadeia lateral ácida (um glutamato nas mitocôndrias, mostrado como uma esfera escura). Ao lado do anel está a subunidade a, que não gira. Ela oferece ao próton dois semicanais: um se abre para o espaço externo, o outro para a matriz.

O truque é que uma cadeia lateral carregada não pode ficar voltada para o interior oleoso da membrana. Uma subunidade c só consegue se afastar da subunidade a depois que um próton pousa no seu glutamato e o neutraliza. Assim, o próton entra pelo primeiro semicanal, dá uma volta completa no anel levado pela sua subunidade c e sai pelo segundo semicanal, para a matriz. Como há mais prótons do lado de fora do que do lado de dentro, eles chegam com mais frequência por um lado do que pelo outro, e o anel gira num só sentido. Pogoryelov e colegas mostraram, em estruturas cristalinas de um anel c15, como o sítio permanece fechado enquanto está voltado para o lipídio e só se abre na subunidade a. No modelo, as esferas no anel são prótons a caminho da volta.

F1, a parte que produz ATP

F1 é um anel de seis subunidades, três α e três β, alternadas como os gomos de uma laranja. Noji e colegas o descreveram como um barril de cerca de 5 nm de raio, e por isso a cabeça do modelo é desenhada com 10 nm de largura. A barra de escala acima da cabeça marca esses 10 nm.

Só as subunidades β produzem ATP. No meio sobe a haste central, formada principalmente pela subunidade γ, cuja parte rotatória tem apenas cerca de 1 nm de raio. O pé dela está preso ao anel c, e por isso a haste gira junto com o anel. Do outro lado, uma longa haste periférica vai da subunidade a até uma tampa no alto de F1 e mantém a cabeça α3β3 parada. Sem esse braço, a cabeça simplesmente giraria com o eixo e nada mudaria lá dentro.

A subunidade γ não é simétrica. Um dos lados tem uma saliência e, ao girar, ela pressiona cada subunidade β na sua vez e muda a forma dela. Ative "Abrir a cabeça" e a metade da cabeça voltada para você desaparece, para que dê para ver a saliência passando.

Três sítios se alternam

Depois de várias décadas de experimentos com isótopos, Paul Boyer descobriu algo incomum sobre essa enzima. Unir ADP e fosfato dentro dela exige pouca energia. A energia é gasta em prender o ADP e o fosfato com firmeza suficiente e, acima de tudo, em soltar o ATP pronto. Ele propôs que os três sítios β se alternam e passam por três estados:

1. Aberto (O): o sítio está vazio ou acaba de liberar um ATP.
2. Frouxo (L): ADP e fosfato se ligam de forma frouxa.
3. Firme (T): o sítio se fecha, e ADP e fosfato se transformam em ATP.

Cada giro de 120° da haste leva cada sítio ao estado seguinte. O sítio firme se abre e libera seu ATP, o frouxo se fecha, e o aberto recebe novos ADP e fosfato. Boyer chamou isso de mecanismo de mudança de ligação e propôs que a haste gira. Ative "Colorir β por estado" e as três subunidades β ficam pálidas para o estado aberto, amarelas para o frouxo e vermelhas para o firme; o painel de leitura escreve os mesmos estados em letras. No passo do guia visto de cima, dá para acompanhar o ADP (esferas branca e laranja) e um fosfato separado se tornando um único ATP antes de sair voando.

John Walker chegou à mesma enzima pela estrutura. Com Jan Pieter Abrahams e Andrew Leslie, ele resolveu em 1994 a estrutura cristalina de F1 de coração bovino a 2,8 Å. As três subunidades β estavam de fato em três formas diferentes, com nucleotídeos diferentes ligados, e a γ assimétrica ficava no centro. A estrutura combinava com o mecanismo de Boyer. Boyer e Walker dividiram metade do Prêmio Nobel de Química de 1997; a outra metade foi para Jens Skou, pela bomba de sódio e potássio, outra enzima de membrana que funciona com ATP. O Comitê Nobel observa que, em repouso, só essa bomba usa cerca de um terço de todo o ATP produzido.

Onde o rotor para

Por que o rotor gira para a frente? Basta contar a energia. Uma volta completa move n prótons através da membrana, sendo n o número de subunidades c, e produz três ATP. Assim, cada ATP recebe a energia de n/3 prótons:

energia recebida por ATP = (n/3) × F × Δp

Produzir um ATP dentro de uma célula também tem um custo definido, o potencial de fosforilação, escrito ΔGp. Ele depende de quanto ATP, ADP e fosfato existem à volta; o modelo começa em 45 kJ/mol, e o controle "Custo de um ATP" o altera. Se a energia recebida é maior que o custo, o rotor gira para a frente e produz ATP. Se é menor, o ATP vence e empurra o rotor para trás. Onde as duas se igualam, o rotor fica parado:

Δp de parada = 3 × ΔGp / (n × F)

Para o anel bovino, n = 8, e a 50 kJ/mol temos 3 × 50.000 / (8 × 96.485) = 0,194 V, ou 194 mV. A 45 kJ/mol são 175 mV. O gráfico do painel de leitura mostra a velocidade do rotor do modelo em função de Δp para o anel e o custo que você escolheu, com uma linha tracejada no ponto de parada e um ponto onde estão seus controles. A tabela sob os controles faz a mesma conta para todos os tamanhos de anel, de c8 a c15.

Duas coisas decorrem disso. Um anel maior para num gradiente menor: o c15 precisa de apenas 93 mV para equilibrar os mesmos 45 kJ/mol, porque traz 15 prótons por volta em vez de 8. E a enzima é reversível. Nada nela decide o sentido do giro; quem decide é o equilíbrio entre as duas energias. A regra de velocidade do modelo (uma curva suave passando pelo ponto de parada) foi inventada para o desenho, mas a posição do ponto de parada é calculada.

Funcionar ao contrário

Baixe o gradiente abaixo do ponto de parada, ou aumente o custo de um ATP, e o painel de leitura passa a indicar "Consome ATP e bombeia prótons". Agora o ATP se liga na cabeça, é quebrado, e a haste gira no outro sentido, em passos de 120°. O anel c leva prótons da matriz para fora, através da membrana. O contador de ATP consumido sobe.

Numa mitocôndria saudável isso raramente acontece, porque a cadeia respiratória mantém o gradiente alto. Quando ele desaba, por exemplo quando o oxigênio acaba, a ATP sintase poderia esvaziar o ATP da célula em poucos minutos funcionando ao contrário. As mitocôndrias têm um freio para isso: uma pequena proteína chamada IF1. Cabezón e colegas mostraram em 2003 que ela se encaixa como uma cunha em uma das interfaces α-β de F1 e toca a γ. No modelo, escolha IF1 como "Inibidor" e reduza o gradiente: o rotor para em vez de girar para trás, e a hélice brilha enquanto o segura.

As bactérias aproveitam o modo reverso. Sem oxigênio, E. coli produz ATP por fermentação e depois deixa a ATP sintase funcionar ao contrário para manter um gradiente de prótons, de que precisa para os flagelos e para levar nutrientes através da membrana. A cena Bactéria mostra isso quando você desliga "Oxigênio". Alguns parentes foram feitos desde o início para o trabalho inverso; eles aparecem na cena V-ATPase.

Fármacos e venenos que a param

Como tanta coisa depende de uma única enzima, várias moléculas naturais e artificiais a atacam. O controle "Inibidor" mostra cinco delas.

• Oligomicina deu nome a Fo. Symersky e colegas a resolveram em 2012 ligada ao anel c10 de levedura: ela fica na parte externa do anel, entre duas subunidades c, e cobre o glutamato que carrega o próton, de modo que nenhum próton consegue se ligar e o rotor para. Os resíduos que formam seu bolso são os mesmos na levedura e nos seres humanos. Os laboratórios a usam para medir quanto da respiração vai para o ATP e quanto se perde em vazamento.
• DCCD (diciclo-hexilcarbodiimida) reage com esse mesmo carboxilato e o bloqueia de forma permanente. Pogoryelov e colegas usaram anéis c15 modificados com DCCD para mostrar como o sítio do próton se abre e se fecha. No modelo, as esferas de glutamato ficam verdes.
• Bedaquilina é um medicamento contra a tuberculose. Andries e colegas a encontraram em 2005 como um composto que mata Mycobacterium tuberculosis; os mutantes resistentes tinham alterado a parte da ATP sintase que carrega os prótons. Em 2015, Preiss e colegas a resolveram sobre um anel c9 de micobactéria: ela cobre os sítios de íons, de modo que o anel não consegue carregar prótons. Eles a descrevem como o primeiro medicamento em 40 anos aprovado para a tuberculose multirresistente. Um estudo de 2024 mostrou que ela também pode se ligar à enzima humana, num local semelhante do anel c.
• DNP (2,4-dinitrofenol) não toca na enzima. Ele leva prótons através do próprio lipídio, de modo que o gradiente desaba e o alimento é queimado como calor, sem produzir ATP. Em 1933 foi vendido como remédio para emagrecer; causa um superaquecimento perigoso, e uma revisão de 2011 contou 62 mortes publicadas. No modelo, os prótons atravessam direto a membrana e o rotor para. A gordura marrom faz uma versão controlada da mesma coisa com uma proteína própria, a UCP1, para manter os animais aquecidos.
• IF1, o freio da própria célula, bloqueia apenas o sentido contrário, como descrito acima.

Anéis de tamanhos diferentes

O tamanho do anel c define o preço de um ATP. Com n subunidades, são necessários n/3 prótons por ATP. Watt e colegas encontraram 8 subunidades c nas mitocôndrias de coração bovino em 2010 e observaram que a sequência da subunidade c é idêntica em quase todos os vertebrados; portanto, muito provavelmente todos os vertebrados pagam 2,7 prótons por ATP. Fungos, bactérias e cloroplastos usam anéis de 9 a 15. A tabela sob os controles lista 13 anéis e as estruturas que os mostram:

Por que não usar o menor anel em todo lugar? Um anel pequeno produz ATP a baixo custo, mas precisa de um gradiente alto para chegar ao ponto de parada; um anel grande funciona com um empurrão mais fraco, mas gasta mais prótons. Bacillus pseudofirmus OF4 vive em água alcalina, onde os prótons fora da célula são escassos, e seu anel c13 reparte cada próton com uma molécula de água ligada. Ilyobacter tartaricus vai além e carrega íons de sódio em vez de prótons. Vollmar e colegas descobriram que os sítios de íons do anel c14 de espinafre ficam a 10,6 a 10,8 Å um do outro, o mesmo espaçamento do anel c11 de Ilyobacter; portanto, um anel com mais subunidades é simplesmente mais largo.

Ajuste "Tamanho do anel c" na cena Enzima e veja o ponto de parada e o custo por ATP se moverem juntos. O controle indica o organismo medido para os tamanhos em que existe um; c12 não tem entrada na tabela.

Dentro de uma mitocôndria

Abra a cena Mitocôndria. A membrana interna de uma mitocôndria é dobrada em cristas; a cena mostra uma dobra em corte transversal, aberta na frente. Fora da dobra fica a matriz. Dentro da dobra há um espaço estreito, ligado ao espaço entre as duas membranas, e é nele que se juntam os prótons bombeados.

Quatro complexos, na lateral da dobra, passam os elétrons do alimento para o oxigênio:

1. Complexo I recebe dois elétrons do NADH e os passa à ubiquinona, um pequeno transportador que se move dentro da membrana. É uma das maiores enzimas da célula: Zhu, Vinothkumar e Hirst localizaram em 2016 todas as 45 subunidades dela na enzima bovina. Ele bombeia 4 prótons para cada dois elétrons.
2. Complexo II leva elétrons do succinato para o mesmo estoque de ubiquinona sem bombear nenhum próton. Ele também faz parte do ciclo do ácido cítrico.
3. Complexo III, o citocromo bc1, passa os elétrons do ubiquinol ao citocromo c e libera 4 prótons no lado externo para cada dois elétrons.
4. Complexo IV, a citocromo c oxidase, entrega os elétrons ao oxigênio, que se transforma em água, e bombeia mais 2 prótons.

Assim, dois elétrons do NADH movem 10 prótons, enquanto dois do succinato movem apenas 6. Watt e colegas usaram esses números para calcular o rendimento. Produzir um ATP com um anel c8 exige 8/3 = 2,67 prótons, e tirá-lo da mitocôndria custa mais um: o transportador que troca ATP por ADP e o que traz o fosfato usam juntos o equivalente a um próton. Isso dá 3,67 prótons por ATP entregue. Então:

• NADH: 10 / 3,67 = 2,7 ATP por átomo de oxigênio
• succinato: 6 / 3,67 = 1,6 ATP por átomo de oxigênio

Essas são as razões P/O. A revisão de Hinkle sobre as medições dá cerca de 2,5 e 1,5, um pouco abaixo, porque alguns prótons voltam pela membrana sem passar pela enzima. O painel de leitura mostra a razão calculada e a que é contada no modelo enquanto ele funciona. Mude "Combustível" para succinato e as duas caem.

As ATP sintases desta cena ficam em pares na crista da dobra. Davies e colegas descobriram, com criotomografia eletrônica de mitocôndrias de levedura, que os pares formam um V com um ângulo de 86° entre eles e se alinham em fileiras ao longo das cristas. Linhagens de levedura que não conseguem formar os pares não têm cristas normais, só cristas em forma de balão ou nenhuma. O modelo atômico da região Fo pareada, de Guo, Bueler e Rubinstein, mostra como o par curva a membrana. No modelo, os pares são quatro formas em V ao longo da crista, e cada cópia gira seu próprio rotor.

A cena funciona como um pequeno circuito de prótons. A cadeia bombeia mais depressa quando o gradiente é baixo e desacelera à medida que ele sobe (controle respiratório); a ATP sintase e um pequeno vazamento deixam os prótons voltar. Experimente também os inibidores aqui. A oligomicina para a ATP sintase, o gradiente sobe e a respiração quase para. O DNP abre um vazamento, o gradiente cai, a respiração dispara e o combustível vira calor; o painel de leitura passa então a mostrar a enzima girando ao contrário, à custa de ATP, o que é o que as mitocôndrias desacopladas fazem se o IF1 não as detém. Desligue "Oxigênio" e a cadeia inteira para.

Dentro de um cloroplasto

A cena Cloroplasto mostra um trecho da membrana do tilacoide. O estroma fica em cima e o lúmen (o interior do tilacoide) embaixo. Aqui a energia vem da luz, não do alimento, mas a enzima é do mesmo tipo, e sua cabeça fica voltada para o estroma.

1. O fotossistema II absorve a luz e arranca elétrons da água. A estrutura a 1,9 Å de Umena e colegas mostra o aglomerado Mn₄CaO₅ onde isso acontece: duas moléculas de água dão um O₂, quatro elétrons e quatro prótons, liberados no lúmen.
2. A plastoquinona leva os elétrons através da membrana até o citocromo b6f, que move mais prótons para o lúmen.
3. A plastocianina, uma pequena proteína de cobre no lúmen, os leva ao fotossistema I, que usa um segundo fóton para elevá-los até a ferredoxina e o NADP⁺. O NADPH se forma no estroma.

Kramer e Evans contam 12 prótons para o lúmen e 2 NADPH para cada O₂ nesse fluxo linear. A enzima do cloroplasto tem um anel c14, portanto precisa de 14/3 = 4,67 prótons por ATP, e 12 prótons produzem 12 × 3 / 14 = 2,57 ATP. São 1,29 ATP por NADPH, mas o ciclo de Calvin usa 3 ATP para cada 2 NADPH, ou seja, 1,5 por NADPH. A diferença é compensada por outros caminhos, como o fluxo cíclico de elétrons em torno do fotossistema I, que bombeiam prótons sem produzir NADPH. O painel de leitura mostra as duas razões e as recalcula se você mudar o anel.

O lúmen fica ácido. Em folhas vivas de Arabidopsis, Takizawa e colegas o estimaram em cerca de pH 7,5 sob luz fraca e cerca de pH 5,7 sob luz forte com pouco CO₂. O gráfico do painel de leitura acompanha o pH do lúmen conforme a luz muda. No modelo, o estroma é fixo em pH 8 e 70 % do gradiente fica armazenado como ΔpH; as duas são escolhas do modelo.

Reduza a luz a zero. Depois de pouco tempo, o painel de leitura diz que o interruptor de γ travou a enzima. A estrutura da enzima completa do cloroplasto, com 26 subunidades, obtida por Hahn e colegas em 2018, mostra um grampo β em γ que atua como um interruptor redox e bloqueia a rotação no escuro.

A enzima do cloroplasto também foi a protagonista de um experimento clássico. Em 1966, André Jagendorf e Ernest Uribe embeberam tilacoides de espinafre em ácido, os passaram para um tampão alcalino com ADP e fosfato e obtiveram ATP no escuro. Uma diferença de pH, sozinha, bastou, como exigia a ideia de Mitchell.

Uma bactéria e seus flagelos

As bactérias não têm mitocôndrias. A cadeia respiratória delas fica na própria membrana da célula e bombeia prótons para fora, no periplasma, o espaço fino entre as membranas interna e externa. A cena Bactéria mostra uma célula de E. coli com cerca de 2 µm de comprimento ao fundo, à direita, e, na frente, um trecho da membrana interna desenhado cerca de 50 vezes maior que a célula.

Duas máquinas desse trecho usam o mesmo gradiente. Uma é a ATP sintase. O grupo de Fillingame mostrou em 2001 que E. coli prefere um anel c10, e a estrutura de crio-EM de Sobti e colegas mostra as dez subunidades e uma subunidade ε que pode se esticar para bloquear a enzima. A outra é o motor flagelar. Howard Berg o descreve com cerca de 45 nm de largura e montado com cerca de 20 tipos de peças; aqui ele é desenhado na mesma escala da ATP sintase, mais de quatro vezes mais largo. Prótons que passam por um anel de unidades do estator em volta da borda giram o rotor, e Meister, Lowe e Berg mostraram que o fluxo de prótons é proporcional à velocidade do motor.

Ao contrário da ATP sintase, esse motor inverte o sentido sob comando. Quando uma proteína chamada CheY leva um fosfato, ela se liga ao anel C, na base do motor, e o muda do sentido anti-horário para o horário. Em E. coli, a rotação anti-horária deixa os filamentos se enrolarem num feixe e a célula nada; a rotação horária desfaz o feixe, e a célula tomba e parte em outra direção. Ative "Flagelos em sentido horário": as esferas rosa de CheY se ligam, os filamentos se espalham e a célula tomba.

Desligue "Oxigênio". A respiração para, o gradiente cai abaixo do ponto de parada do anel c10, e a ATP sintase começa a funcionar ao contrário, usando o ATP da fermentação e bombeando prótons para fora para manter o motor girando. O gradiente se estabiliza um pouco mais baixo e a célula continua nadando, mais devagar.

Bombas feitas para o sentido inverso

Alguns parentes da ATP sintase gastam ATP como trabalho normal. As ATPases vacuolares, ou do tipo V, bombeiam prótons para dentro de compartimentos da célula para torná-los ácidos. Os lisossomos, as bolsas digestivas da célula, são mantidos entre pH 4,5 e 5, faixa em que suas enzimas funcionam. A revisão de Mindell explica que a bomba não consegue fazer isso sozinha: à medida que os prótons entram, a carga se acumula, e por isso outro íon também precisa se mover. Um trocador de cloreto e próton, o ClC-7, é parte da resposta, e a cena o mostra ao lado das bombas.

A cena V-ATPase mostra duas bombas num trecho da membrana de um lisossomo, com o lisossomo inteiro, pequeno, ao fundo; sua cor acompanha o pH interno. As partes parecem familiares: uma cabeça de três subunidades A e três B (as equivalentes de β e α), um rotor central e um anel na membrana. As diferenças também são visíveis. A crio-EM da enzima de levedura, de Zhao, Benlekbir e Rubinstein, mostra três hastes periféricas em vez de uma e um anel formado por mais de um tipo de proteolipídio; Mazhab-Jafari e colegas os identificaram depois como c8, c′ e c″. Murata e colegas resolveram o rotor de dez subunidades de uma bomba de sódio aparentada de Enterococcus hirae.

A V-ATPase também tem um interruptor que a enzima do tipo F não tem: suas duas metades podem se separar. Quando a levedura fica sem glicose, a cabeça V1 solta o anel Vo e o bombeamento para. Mazhab-Jafari e colegas usaram exatamente isso para obter o anel Vo livre e construir seu modelo atômico. Ative "Jejum: V1 se separa": a V1 se solta, as cabeças se levantam e o lúmen volta devagar para perto da neutralidade.

Ver o giro

Até 1997, a rotação ainda era uma dedução. Hiroyuki Noji, Ryohei Yasuda, Masasuke Yoshida e Kazuhiko Kinosita fixaram F1 a uma superfície de vidro pelas subunidades β, de cabeça para baixo, prenderam um filamento fluorescente de actina à subunidade γ e adicionaram ATP. Ao microscópio, o filamento girou por mais de 100 voltas, sempre no sentido anti-horário visto do lado da membrana. F1 sozinha não produz ATP; recebendo ATP, ela o quebra e gira a haste no sentido oposto ao da síntese.

A cena Teste de giro reconstrói isso. A vista principal é o que o microscópio via: o vidro e um filamento verde girando em torno de uma das pontas. A imagem pequena ao lado mostra a própria F1, desenhada cerca de 50 vezes maior, com a γ girando na cabeça fixa.

O filamento não é movido a uma velocidade definida de antemão. O motor empurra com um torque de cerca de 40 pN·nm, e a água faz arrasto sobre o filamento. Para uma haste girando em torno de uma ponta, o arrasto cresce com o cubo do comprimento:

arrasto = (4π/3) η L³ / (ln(L / 2r) − 0,447)

onde η é a viscosidade da água e r o raio do filamento. Um filamento de 1 µm resulta em cerca de 6,3 voltas por segundo, e um de 2 µm em menos de uma volta por segundo. Mude "Comprimento da actina" e o painel de leitura refaz o cálculo; o rótulo "arrasto da sonda" quer dizer que é o filamento, e não a enzima, que define a velocidade.

Trabalhos posteriores usaram marcadores menores. Yasuda e colegas descobriram em 1998 que, com pouco ATP, o filamento se move em passos discretos de 120°, um por ATP, e que o trabalho realizado em cada passo permanece quase igual numa ampla faixa de cargas, próximo da energia livre da hidrólise de um ATP. Com uma esfera de ouro de 40 nm, leve o bastante para não frear o motor, eles dividiram em 2001 cada passo em subpassos de aproximadamente 90° e 30°, e mediram cerca de 130 voltas por segundo quando havia muito ATP. Sakaki e colegas encontraram o mesmo torque de cerca de 40 pN·nm com 2 mM, 60 nM e 2 nM de ATP, e uma taxa de ligação de 2 × 10⁷ por molar por segundo.

O modelo usa esses números. Cada ATP se liga após uma espera aleatória cuja média é 1 / (kon × [ATP]); depois, a sonda gira 120° tão depressa quanto o torque consegue arrastá-la. Baixe a concentração de ATP para cerca de 0,2 µM e as esperas ficam mais longas que os giros: o filamento passa a saltar, e o gráfico desenha uma escada. Escolha a esfera de ouro e os passos ficam nítidos, porque a esfera quase não freia o motor; o painel de leitura diz então que a ligação de ATP define a velocidade, e a reprodução é desacelerada para que você possa acompanhar.

O último passo inverteu o experimento. Itoh e colegas prenderam uma esfera magnética à γ e a giraram ao contrário com eletroímãs, em 2004. Apareceu ATP na solução. Rondelez e colegas fecharam moléculas individuais de F1 em câmaras de alguns femtolitros e descobriram que até 77 % das voltas forçadas produziam ATP quando a pequena subunidade ε estava presente. Escolha "Esfera magnética" e ative "Ímãs giram ao contrário": as bobinas acendem uma de cada vez, a esfera gira no sentido horário e cada 120° soma um ATP ao contador.

Conferir os números

Cada subunidade c leva um próton por volta, e cada volta produz três ATP. Portanto, o número de prótons por ATP é o número de subunidades c dividido por 3: 8 ÷ 3 = 2,67 para o anel bovino, 10 ÷ 3 = 3,33 para levedura e E. coli, 14 ÷ 3 = 4,67 para espinafre e 15 ÷ 3 = 5,00 para Spirulina platensis.

Watt e colegas dão a velocidade do rotor nas mitocôndrias como cerca de 100 voltas por segundo. Com 3 ATP por volta, isso dá cerca de 300 ATP por segundo para uma única enzima e, com 8 subunidades c, cerca de 800 prótons por segundo passando por ela. O modelo gira cerca de 100 vezes mais devagar, até 1,2 volta por segundo, para que você consiga acompanhar as esferas.

A equipe de Noji mediu um torque de cerca de 40 pN·nm. Um passo de 120° equivale a 2π/3 de radiano, de modo que o trabalho realizado em um passo é de cerca de 40 × 2,09 ≈ 84 pN·nm, ou 8,4 × 10⁻²⁰ J. Um ATP a 50 kJ/mol contém 50.000 / (6,022 × 10²³) ≈ 8,3 × 10⁻²⁰ J, ou 83 pN·nm. Os dois números são quase iguais: o motor transforma em trabalho quase toda a energia química, como Yasuda e colegas relataram. O painel de leitura do Teste de giro mostra os dois, e a energia do ATP acompanha o controle "Custo de um ATP".

O ponto de parada é a mesma conta ao contrário. A 50 kJ/mol, um anel c8 exige (8/3) × 96.485 × Δp = 50.000 J, o que dá Δp = 0,194 V. Um anel c14 se equilibra em 0,111 V e um c10 em 0,155 V.

Um dia de ATP

Quanto ATP uma pessoa produz por dia? O Laboratório, sob os controles, tem uma pequena calculadora. Ela parte do oxigênio. Um MET, o ritmo de repouso usado em testes de esforço, é de 3,5 mL de oxigênio por quilograma de massa corporal por minuto; assim, um adulto de 70 kg em repouso absorve cerca de 245 mL por minuto. Em um dia, são 245 × 1440 = 352.800 mL, ou 352,8 L, que, a 22,414 L por mol (volume de gás a 0 °C e 1 atmosfera, que é como se relata a absorção de oxigênio), correspondem a cerca de 15,7 mol de O₂, ou 31,5 mol de átomos de oxigênio.

Com uma razão P/O de 2,5, isso dá 31,5 × 2,5 ≈ 79 mol de ATP. O ATP pesa 507,18 g por mol, então 79 mol são cerca de 40 kg: um pouco mais da metade da massa corporal, de acordo com o valor de cerca de metade do Comitê Nobel. Num esforço intenso, a absorção de oxigênio pode subir várias vezes, e o ATP do dia sobe junto. A calculadora também funciona no sentido inverso: com P/O 2,5, uma pessoa de 70 kg precisaria de cerca de 430 mL de oxigênio por minuto para que o ATP de um dia pesasse tanto quanto o corpo.

Quantas enzimas isso exige? 79 mol são 4,7 × 10²⁵ moléculas. Uma enzima que faz 300 por segundo faz 2,6 × 10⁷ por dia, de modo que o corpo precisa de cerca de 1,8 × 10¹⁸ delas girando o tempo todo. Tudo isso é renovação: o corpo guarda só uma pequena quantidade de ATP a cada instante e o refaz sem parar.

Quando a enzima falha

A subunidade a, a parte fixa do estator por onde passam os prótons, é feita a partir de um gene do próprio DNA das mitocôndrias, o MT-ATP6. O MedlinePlus Genetics, mantido pela Biblioteca Nacional de Medicina dos Estados Unidos, lista as doenças causadas por alterações nesse gene. Cerca de 10 % das pessoas com síndrome de Leigh, uma doença cerebral progressiva que em geral começa na infância ou na primeira infância, têm uma alteração no MT-ATP6; a mais comum é uma troca de uma única letra, escrita T8993G. As mesmas alterações podem causar uma doença mais leve chamada NARP (neuropatia, ataxia e retinite pigmentosa). Cada célula tem muitas mitocôndrias, e a gravidade tende a acompanhar a proporção das que carregam a alteração: tipicamente 70 a 90 % na NARP e mais de 90 % na síndrome de Leigh.

A estrutura da enzima humana de 2023, de Lai e colegas, localizou mutações causadoras de doença no complexo e encontrou a maioria delas nos contatos entre subunidades, onde podem enfraquecer a máquina inteira. Esta exposição não é uma referência médica; para questões de saúde, consulte um médico.

O que o modelo omite

• As formas são volumes lisos colocados onde ficam as subunidades. Não são as superfícies de proteína medidas, das entradas do PDB citadas na tabela.
• A regra de velocidade foi inventada para o modelo: uma curva suave passando pelo ponto de parada calculado. As enzimas reais têm uma relação mais complicada entre força e velocidade, e o rotor real gira cerca de 100 vezes mais depressa.
• Na síntese, o modelo gira em passos pequenos, um por próton. No sentido inverso, mostra os passos de 120° medidos em F1, mas não os subpassos de 90° e 30°; estes aparecem apenas no Teste de giro, com a esfera de ouro.
• Murphy e colegas descobriram que a cabeça F1 acompanha o rotor nos primeiros 30° ou mais de cada passo de 120°, numa dobradiça flexível. O modelo mantém a cabeça parada.
• As pequenas subunidades do pé da haste são desenhadas como uma só peça, e as cópias da ATP sintase nas outras cenas compartilham uma única forma simplificada.
• Os circuitos de prótons nas cenas Mitocôndria, Cloroplasto e Bactéria, e a curva de pH na cena V-ATPase, têm taxas inventadas. A estequiometria deles (10 e 6 prótons, 12 prótons por O₂, n/3 por ATP) vem das fontes.

Uma breve história

• 1929: Karl Lohmann descobre o ATP. Alexander Todd o sintetiza em 1948.
• 1939 a 1941: Fritz Lipmann mostra que o ATP leva energia pela célula.
• 1957: Jens Skou descreve a bomba de sódio e potássio.
• 1960: O grupo de Efraim Racker isola a enzima das mitocôndrias.
• 1961: Peter Mitchell propõe a ideia quimiosmótica; Prêmio Nobel em 1978.
• 1966: Jagendorf e Uribe produzem ATP no escuro com um banho ácido.
• 1974: Racker e Stoeckenius produzem ATP com luz em vesículas artificiais.
• 1994: Abrahams, Leslie, Lutter e Walker resolvem a estrutura de F1.
• 1997: Noji e colegas veem a haste girar; Boyer, Walker e Skou dividem o Prêmio Nobel de Química.
• 2001: Yasuda e colegas resolvem os subpassos de 90° e 30°.
• 2004: Itoh e colegas produzem ATP girando F1 com ímãs.
• 2010: Watt e colegas encontram o anel c8 em mamíferos.
• 2015 a 2023: a crio-EM mostra enzimas completas de bovino, levedura, bactérias, cloroplastos e seres humanos em seus estados de rotação.