CRISPR-Cas9：基因编辑怎样工作

蛋白质如何在整个基因组中找到一个位置？

人类基因组的一个拷贝含有约 30 亿个碱基对。假设你想改变一个基因。你需要一种能读取 DNA、识别其中一小段并在那里切割，同时不碰其他任何片段的工具。早期工具锌指核酸酶和 TALENs 需要为每个靶点重新设计蛋白质，而蛋白质设计既缓慢又困难。CRISPR-Cas9 改变了这种情况。蛋白质保持不变，只需改写一段短小的向导 RNA。

本展品以分子尺度构建这一系统。一小段 DNA 横在场景中，Cas9 携带向导 RNA 到来。你可以跟随它，看它找到 PAM 序列，将向导与 DNA 的 20 个碱基配对，切断两条链，再让细胞修复断裂。模型上方有一个输入框，你可以输入自己的向导。如果字母不匹配，向导就停止配对，不发生切割。数值来自 Nobel Committee for Chemistry、OpenStax、RCSB Protein Data Bank 和美国 National Human Genome Research Institute。参考资料列在文末。

模型尺度下的 DNA

DNA 由两条互相缠绕的链构成。每条链都是糖和磷酸组成的长链，每个糖上带着四种碱基之一：A、C、G 或 T。一条链上的 A 与另一条链上的 T 配对，C 与 G 配对，因此可以根据任意一条链读出它的互补链。模型中，A 为绿色，T 为红色，G 为黄色，C 为蓝色。RNA 中代替 T 的碱基 U 为紫色。

DNA 的常见形式 B-DNA 具有固定的尺寸。双螺旋宽 2 nm。相邻碱基对间距为 0.34 nm，螺旋每隔 3.4 nm 转一整圈，也就是 10 个碱基对。模型左端的黑色标尺显示 2 nm 的宽度和 3.4 nm 的一圈。模型有 44 个碱基对，因此长 44 × 0.34 = 15 nm。

两条链的方向相反。化学家用 5′ 和 3′ 标记两端，序列按 5′ 到 3′ 的方向书写。模型中的灰色链从左到右按 5′ 到 3′ 排列，深色链则方向相反。灰色链的字母与向导相同（向导中的 U 在这里为 T），深色链则是与向导配对的那条链。

细菌对病毒的记忆

CRISPR 最初是细菌基因组中的一个谜。1987 年，研究人员在 Escherichia coli 的 DNA 中发现一种奇怪的模式：一段 29 个碱基对的序列重复出现五次，中间各隔着 32 个碱基对，而且每段间隔的序列都不同。许多细菌和古菌中也发现了类似阵列，人们为其取名 CRISPR，意为成簇规律间隔短回文重复序列。阵列旁有一组基因，因与 CRISPR 相关而命名为 cas，它们编码的蛋白质类似于解开和切割核酸的酶。

2005 年，三个团队报告，重复序列之间的间隔序列与病毒和质粒的 DNA 匹配。携带某个间隔序列的细菌很少被具有匹配序列的病毒感染。2007 年，一项使用 Streptococcus thermophilus 的实验直接证实了这种联系。在病毒攻击后存活的细菌获得了从该病毒复制而来的新间隔序列，这些细菌现在能抵抗它。移除间隔序列，抗性也随之消失。

因此，CRISPR 阵列相当于过去感染的记录。阵列被复制成长 RNA，再被切成短小的 CRISPR RNA，每个间隔序列对应一段。每段短 RNA 与 Cas 蛋白结合，引导它们找到具有匹配序列的 DNA。Streptococcus 系统只需一种蛋白质 Cas9 来切割，同时还需要另一种小 RNA，即 Emmanuelle Charpentier 团队于 2011 年描述的 tracrRNA。

Cas9 及其向导 RNA

来自 Streptococcus pyogenes 的 Cas9 是一种大蛋白质。Protein Data Bank 中晶体结构 4OO8 的蛋白链含有 1,372 个氨基酸，重约 159 kDa。这一于 2014 年以 2.5 Å 分辨率解析的结构显示出两个叶。识别叶（REC）容纳向导 RNA 和 RNA-DNA 配对结构。核酸酶叶容纳 HNH 和 RuvC 两个切割结构域，其远端附近还有一个与 PAM 相互作用的结构域。

模型将蛋白质画成位于相应位置的四个柔软团块。形状是虚构的，采用透明外观，让你能看清内部的 RNA 和 DNA。在「操作」选项卡中开启「查看内部」，可以让它们更透明。

在细菌中，Cas9 携带两种 RNA：含有间隔序列的 crRNA，以及将其固定在位的 tracrRNA。2012 年，Charpentier、Jennifer Doudna 及其同事将两者连接成一条单一向导 RNA。向导分为两部分。前 20 个字母构成间隔序列，用来选择靶点。其余部分折叠成支架，位于蛋白质内部，在模型中画成橙色管状结构。改变这 20 个字母，同一种蛋白质就会去往不同位置。

第一步：寻找 PAM 序列

Cas9 并不会用向导逐段检验所有 DNA。它首先寻找原间隔序列邻近基序，即 PAM 序列。对于来自 S. pyogenes 的 Cas9，它是灰色链上紧接靶点之后的 NGG：任意一个碱基，后跟两个 G。与 PAM 相互作用的结构域中的两个精氨酸通过氢键识别 GG。只有找到 PAM 序列后，蛋白质才会弯曲旁边的 DNA，并开始将两条链拉开。

PAM 序列也回答了一个关于细菌的问题。如果间隔序列匹配病毒 DNA，它也匹配 CRISPR 阵列中自身的拷贝。细菌之所以不会切割自己的基因组，是因为阵列中的间隔序列旁没有 PAM 序列，而病毒中的匹配序列旁有。

模型中的 PAM 序列是 TGG。在「操作」选项卡中关闭「PAM（NGG）」，它就变成 TGA。此时即使向导仍与全部 20 个碱基匹配，Cas9 也只会悬在 DNA 上方，然后飘走，不将其打开。

第二步：从种子区开始配对二十个字母

紧挨 PAM 序列处，DNA 一次打开一个碱基对，向导 RNA 与深色链配对。灰色链被推到一旁，形成一个环。这种 RNA 与一条 DNA 链配对、另一条链被排开的结构称为 R 环。配对从 PAM 端开始，向导中最靠近 PAM 序列的 10 个碱基，也就是种子区，最为重要。种子区中的错配通常会阻止识别。

模型上方的框显示灰色链上从 5′ 到 3′ 的靶序列，末端是 PAM 序列。10 个种子区位置带有底色。下方是向导。你可以在框中输入，或使用四个按钮：

• 匹配：全部 20 个字母配对。R 环延伸到远端，Cas9 进行切割。
• 种子区错配：第 17 位被改变。R 环打开 3 个碱基对后停止。
• 远端错配：第 3 位被改变。R 环打开 17 个碱基对，随后重新闭合。
• 其他基因：为其他序列编写的向导。没有任何配对。

不配对的字母显示为黑色。模型中，任何错配都会使配对停在该字母处，DNA 闭合，Cas9 脱离。真实 Cas9 没有这么严格，后续章节将作说明。

第三步：两个结构域，切割两条链

当向导与全部 20 个碱基配对后，HNH 结构域改变形状，摆到深色链旁的切割位置。每个核酸酶结构域切割一条链。HNH 切割与向导配对的链，RuvC 切割被排开的灰色链。两处切口都在 PAM 序列前 3 个碱基对处，且位于两条链的同一位置，因此两端通常是平齐的，而不是交错的。

模型中，从左边数，切口位于第 27 和第 28 个碱基对之间，PAM 一侧还剩三个靶序列碱基对。切口处闪现黄色圆环。随后 Cas9 抬起，两端分开。

如果两个结构域中的一个失活，Cas9 就只切一条链。这种切口酶会与两条向导搭配使用，两条向导靶向相距很近的相反链，只有两条向导都匹配的位置才会形成断裂。

细胞如何处理断裂的染色体

Cas9 只负责造成断裂。真正的编辑由细胞自身的修复系统完成，这些系统一直在处理断裂的 DNA。主要有两条途径。

第一条是非同源末端连接，即 NHEJ。细胞将两端重新粘合。这通常会在连接处增加或丢失几个碱基。在基因内部，改变一两个碱基就会使后续每个密码子的阅读框移位，基因往往就不再产生其蛋白质。使用「进度」滑块或导览第 7 步，可以看到模型在连接两端时增加一个碱基对，并以圆环标出。

第二条是同源定向修复，即 HDR。如果存在一段与断裂两侧匹配的 DNA，细胞可以用它作模板，将其序列复制到缺口处。提供中间字母已改变的模板，研究人员就能将选定的改变写入基因组。开启「修复模板」，断裂旁会出现绿色模板；两端连接时，切口处的三个碱基对会采用模板的字母。

核对数值

为什么 20 个字母就够了？每个位置有 4 种选择，因此共有 4^20 = 1,099,511,627,776 种不同的 20 字母序列，约为 1.1 × 10^12。人类基因组约有 3 × 10^9 个碱基对，而序列可能位于任意一条链上，因此约有 6 × 10^9 个位置需要查找。如果基因组是随机的，某个给定的 20 字母序列偶然出现的次数约为 6 × 10^9 ÷ 1.1 × 10^12 ≈ 0.005。在这一随机模型下，所选靶序列再出现一个完全相同拷贝的可能性很小；这并不是对真实基因组的保证。

种子区的情况则不同。十个种子区字母加上 PAM 序列的两个 G，固定了 12 个字母，而 4^12 = 16,777,216。随机序列中出现这一模式的次数约为 6 × 10^9 ÷ 1.7 × 10^7 ≈ 360。即使向导远端匹配不佳，Cas9 有时仍能切割这类位点，这就是向导序列在使用前要与整个基因组核对的原因。真实基因组中还充满重复序列，因此实际情况比随机估计更不利。

模型中的靶序列长 20 × 0.34 = 6.8 nm，相当于螺旋的两个整圈。切口距 PAM 序列 3 个碱基对，约为 1 nm。

在屏幕上尝试

模型从搜索开始。Cas9 沿一段短小的虚构 DNA 滑动，在每个 NGG 标记处停下，只有向导匹配的位置才会打开双螺旋并将其切断。图中的字母是虚构的：它展示原理，而不是实验室方法。

• 按下场景中字母条上的一个 NGG 标记。Cas9 就会前往那里，向导不配对时，它会脱离并继续移动。
• 沿 DNA 拖动 Cas9 本身，将其放在一个 NGG 标记上。
• 选择靠近 PAM 序列处有一个错误字母的向导，或关闭 PAM 序列，观察 Cas9 无法切割。
• 按下蛋白质的各个部位，阅读 HNH 和 RuvC 结构域、REC 叶以及与 PAM 相互作用的结构域各自的作用。
• 打开细菌故事，看看细菌如何储存一段病毒 DNA，并在病毒下次攻击时使用它。
• 操作区下方有挑战、隐藏内容、与头发和细胞的大小比较，以及从 1987 年到首款获批药物的 CRISPR 历史。

模型省略了什么

蛋白质由四个团块构成，并非实测的表面，HNH 结构域也只是从一个位置滑到另一个位置。DNA 是笔直、规则的螺旋，每圈恰好有 10 个碱基对，而真实 DNA 在 Cas9 紧握的 PAM 序列旁会发生弯折。R 环整齐地一次打开一个碱基对；真实过程也逐步推进，但速度并不均匀。切割后 Cas9 抬起，让你看清两端，模型没有显示真实蛋白质会保持结合多长时间。

错配规则也比真实情况简单。真实 Cas9 可以容忍远离 PAM 序列的某些错配，并可能切割这些脱靶位点。修复只展示每条途径的一个例子：NHEJ 增加一个碱基对，HDR 改变三个碱基对。在细胞中，NHEJ 会产生多种小片段插入和缺失，而不是一个固定结果。模型序列是编造的，并不属于真实基因。

从细菌之谜到实验室工具

Charpentier 研究 Streptococcus pyogenes 时发现了 tracrRNA，并于 2011 年 3 月发表。同年春天，她在波多黎各的一次会议上遇到加州大学伯克利分校的生物化学家 Doudna，两人决定共同研究 Cas9。在试管中，仅携带 crRNA 的 Cas9 并不切割 DNA。加入 tracrRNA 后，DNA 被切断。随后，她们将两种 RNA 融合成一条向导，并证明改变其序列就能在选定位置切割 DNA。论文于 2012 年发表。2013 年初，其他团队证明这一系统可在人体和小鼠细胞中编辑基因组。

Royal Swedish Academy of Sciences 将 2020 年诺贝尔化学奖授予 Emmanuelle Charpentier 和 Jennifer A. Doudna，以表彰她们「开发出一种基因组编辑方法」。

它用在哪里

据 Nobel Committee 介绍，CRISPR-Cas9 现已成为基础研究的常规工具，用于改变细胞和实验动物中的基因，以了解其功能。它也用于植物育种；委员会的概述以经编辑后从土壤吸收更少镉和砷的水稻品种为例。美国 National Library of Medicine 的 MedlinePlus 指出，研究和临床试验正在探索用基因组编辑治疗多种疾病，而编辑卵细胞、精子或胚胎目前在美国及许多其他国家属于违法行为。

一种使用 CRISPR-Cas9 制造的药物已在欧盟获准上市。European Medicines Agency 于 2024 年 2 月 9 日向 Casgevy（exagamglogene autotemcel）授予有条件上市许可，用于 12 岁及以上患有输血依赖型 β 地中海贫血或重度镰状细胞病的人。它由患者自身的造血干细胞制成，细胞在体外经过编辑，以产生更多胎儿血红蛋白。有条件许可意味着公司必须在获批后提供进一步证据。本展品不对任何治疗的效果或安全性作出判断；详细信息见该机构的页面。

为什么独一无二的靶序列仍可能脱靶切割

上述随机序列计算统计的是完全匹配，而不是酶可能接受的所有序列。假设我们允许一条 20 碱基向导中有一个错误字母。有 20 个位置可以改变，每个位置有 3 个替代字母，因此有 20 × 3 = 60 个单错配邻近序列。加上完全匹配的序列，共有 61 种可能的字符串。以含有 3,200,000,000 个碱基对的示例基因组为例，计入两条链后，约有 6,400,000,000 个候选起始位置。在刻意采用的、不符合现实的假设下，即各碱基彼此独立且出现频率相等，指定向导的完全匹配预期次数为 6,400,000,000 ÷ 4^20 ≈ 0.0058。计入完全匹配序列及那 60 个邻近序列后，在尚未要求 PAM 序列之前，预期次数升至约 0.36。

对于 NGG，N 可以是任意碱基，而在这一简化基因组中，两个 G 各自出现的概率为 1/4。因此，要求 NGG 就将上述预期次数乘以 1/16。61 种字符串的结果约为 0.022。这些是偶然序列模式的预期次数，不是临床风险百分比，也不是测得的切割率。它们不包含预定靶点，因为选择该靶点就是因为它确实存在。它们也不意味着每种允许的错配都会被切割。重复序列、碱基频率不均、DNA 包装、患者的变异以及错配位置，都会破坏这些简单假设。即使随机模型预测匹配极少，重复基因仍可能提供一个几乎相同的靶点。

因此，向导设计从搜索相关基因组开始，并继续通过实验测量验证。预测的脱靶位点是需要调查的位置，而不是损伤的证据；未检出切割也受检测方法灵敏度的限制。2016 年，Kleinstiver 及其同事报告了 SpCas9-HF1，其经过工程改造，以削弱与 DNA 的非特异性接触。它对许多受试向导仍保持较强活性，同时降低了可检测到的脱靶活性。标题中的「未检测到」一词仅适用于那些测试，而不适用于每种细胞和每条向导。高保真酶在某些靶点可能丧失有用活性，因此必须同时检查特异性和效率。展品中任何错配都会停止切割的规则只是教学简化，并不是对这种改造蛋白质的模拟。

不造成双链断裂也能改变字母

本展品的修复模板开关表示断裂后的 HDR。它并不代表所有类型的精确编辑。2016 年，Komor 及其同事描述了一种碱基编辑器，将靶向 DNA 的 Cas9 组分与胞嘧啶脱氨酶结合。脱氨酶将暴露 DNA 中的胞苷转化为尿苷；后续处理可产生 C 到 T 的替换，若从相反链描述，则是 G 到 A。后来的设计使用只切割一条链的切口酶，以促进所需结果。避免有意造成双链断裂，并不意味着 DNA 从未出现单链切口，也不意味着不可能产生非预期产物。

碱基编辑器在一个编辑窗口内发挥作用，而不是可以改变向导旁任何位置的任意字母。该窗口内其他可编辑碱基也可能改变，产生旁观者编辑。PAM 序列是否可用仍限制着靶向装置的结合位置。能否递送到正确细胞、是否在别处发生非预期编辑，以及获得所需改变的细胞比例，仍是实验需要回答的问题。当碱基编辑器的化学转化符合所需改变时，它才有用；它不是能任意改写基因组的拼写纠错器。

Anzalone 及其同事于 2019 年描述的先导编辑，使用与逆转录酶连接的 Cas9 切口酶。其延长的先导编辑向导 RNA，即 pegRNA，既定位靶点，也携带编码拟议改变的模板。酶将该 RNA 中的信息复制到 DNA，随后细胞必须处理经过编辑的中间体。这可以实现替换以及小片段插入或缺失，而无需提供单独的供体 DNA，也无需有意造成双链断裂。它仍依赖细胞修复，效率和非预期产物取决于靶点与设计。这里没有演示碱基编辑或先导编辑的动画。「修复模板」显示的绿色供体是为 HDR 提供的 DNA，而不是 pegRNA，双链切割则属于常规 Cas9 编辑。

Casgevy 在患者细胞中改变了什么

Casgevy 是体外编辑的具体实例。英国 MHRA 于 2023 年 11 月 16 日宣布批准；公告记载实际批准日期为 11 月 15 日。2023 年 12 月 8 日，美国 FDA 批准 Casgevy 用于 12 岁及以上患有镰状细胞病且反复发生血管闭塞危象的患者。适应证和使用条件必须查阅各监管机构的规定，不能假定各国相同。这些日期描述的是最初决定，而不是后续批准的完整清单。

镰状细胞病涉及异常的成人血红蛋白，可使红细胞变硬、呈镰刀状并阻碍血流。Casgevy 并不直接替换全身每个细胞中的镰状细胞病突变。医生从患者体内采集造血干细胞，在体外用 CRISPR-Cas9 编辑，再通过输注送回体内。编辑作用于胎儿血红蛋白的调控，使接受处理的干细胞所产生的红细胞后代能够制造更多这种血红蛋白。即使原有遗传突变仍然存在，胎儿血红蛋白也可以减少镰变。因此，改变调控因子可以弥补疾病影响，而无需修复其原有 DNA 拼写。

输注只是复杂治疗流程的一部分。FDA 解释，患者首先接受大剂量化疗，为改造后的细胞准备骨髓环境。采集、制造、预处理、植入和随访都关系到结果；单靠向导序列并不构成治疗。使用的是患者自身细胞，但这并不能消除化疗风险，也不能免除长期监测编辑细胞的需要。这是体细胞治疗：经过编辑的造血细胞不会成为卵细胞或精子，治疗也不以将编辑传给子女为目的。模型展示的是一个虚构 DNA 靶点上的识别、切割和修复。它没有模拟 Casgevy 的靶点、临床制造、患者资格或个体获益的可能性。

关于可遗传编辑，屏幕无法回答的问题

编辑造血干细胞和编辑胚胎引发的问题不同。胚胎编辑可能影响发育中个体全身的组织，包括日后产生卵细胞或精子的细胞。改变随后可能遗传给无法表示同意的后代。如果只有部分早期细胞被编辑，个体就可能成为嵌合体，不同细胞群具有不同的 DNA 改变。一个样本中看起来干净的序列，并不能证明每个组织都携带相同编辑。即使改变完全落在正确位置，也不能证明拟议用途在医学上合理或能被公平获得。

WHO 的 2021 年建议区分了体细胞、生殖系和可遗传编辑，并呼吁建立治理机制、登记制度、国际合作，以及举报非法、未登记、不合伦理或不安全研究的途径。这些建议是监督框架，而不是国际通行许可，也不是自动取代各国规定的法律。2020 年诺贝尔奖表彰了 Charpentier 和 Doudna 开发基因组编辑方法的工作；科学奖项并不等于批准该方法的一切可能用途。

使用屏幕，将分子层面的观察与更广泛的主张分开。先启用「匹配」和「PAM（NGG）」，再将「进度」推进到切割和修复。在保持向导不变的情况下关闭「PAM（NGG）」并重复：仅有匹配地址并不够。恢复 PAM 序列，比较「种子区错配」与「远端错配」。两者在这里都会阻止切割，但配对停止的位置不同，因此这不是它们生物学风险相同的证据。最后比较有无「修复模板」时的修复。显示的产物说明两种修复途径，而不是它们在细胞中的发生频率。每次运行都记下 PAM 序列是否存在、配对停在哪里，以及出现哪种修复产物。这些观察都不能衡量治疗安全性、胚胎存活能力或知情同意。